分子生物學常用技術

　　核酸分子雜交技術


這種技術是利用高度特異性以及檢測方法的靈敏性，現(xiàn)在已經(jīng)成為zui基本的技術了，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛用于基因克隆了，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強度等）可按堿基互補原成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針（probe）,待測核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補的已知DNA或RNA片段。根據(jù)其來源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。


固相雜交


固相雜交（solid-phase hybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。


斑步雜交（dot hybridization）


是道先將被測的DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過量的標記好的DNA或RNA探針進行雜交。該法的特點是操作簡單，事先不用限制性內(nèi)切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，可在同一張膜上同時進行多個樣品的檢測;根據(jù)斑點雜并的結果，可以推算出雜交陽性的拷貝數(shù)。該法的缺點是不能鑒定所測基因的相對分子質(zhì)量，而且特異性較差，有一定比例的假陽性。


印跡雜交（blotting hybridization）


Southern印跡雜交：凝膠電離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤固定，再與相對應結構的已標記的探針進行那時交反應，用放射性自顯影或酶反應顯色，檢測特定大小分子的含量?？蛇M行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長度多態(tài)性分析（RELP）等。


Northern印跡雜交:由Southerm印雜交法演變而來，其被測樣品是RNA。經(jīng)甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉移到固相支持物上，進行雜交反應，以鑒定基中特定mRNA分子的量與大小。該法是研究基因表達常用的方法，可推臬出癌基因的表達程度。


差異雜交（differential hybridization）


是將基因組文庫的重組噬菌體DNA轉移至硝酸纖維素膜上，用兩種混合的不同cDNA探針（如：轉移性和非轉移性癌組織的mRNA逆轉錄后的cDNA）分別與濾膜上的DNA雜交，分析兩張濾膜上對應位置雜交信息以分離差異表達的基因。適用于基因組不太復雜的真核生物（如酵母）表達基因的比較，假陽性率較低。但對基因組非常復雜的鹽酸核生物（如人），則因工作量太大，表達的序列所占百分比較低（僅5%左右），價值不大。


cDNA微點隈雜交（cDNA microarray hybridization）


是指將cDNA克隆或cDNA的PCR產(chǎn)物以高度的列陣形式排布并結合于固相支持物上（如：尼龍膜或活化的載玻片）以微點陣，然后用混合的不同DNA探針與微點陣上的DNA進行雜交。再利用熒光、化學發(fā)光、共聚焦顯微鏡等技術掃描微點陣上的雜交信息。它比差異雜交技術的效率高、速度快、成本低，適用于大規(guī)模的分析。已成商品問世。其缺點是無法克服保守的同源序列及重序?qū)﹄s交信息的干擾。


寡核苷酸微點隈雜交（oligonucleotide microarray hybridization）


是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共價結合于支持物表面，與平均長度為20-50nt的混合RNA或cDNA探針進行雜交，以提高雜交的特異性和靈敏度。應用共聚焦顯微鏡可檢測跨越三個數(shù)量級的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測，以區(qū)分基因家族不同成員的差異表達特征，或鑒定同一轉錄在不同組織和細胞中的選擇性剪接。但有工作量較大、成本較高、速度較慢等弱點。


液相雜交（solution hbridization）


指使變性的待測核酸單鏈與放射笥核素標記的已知的酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復合物。反應結束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開，然后結膈后在雜妝分子中的探針量，就可推算出被測的核酸量。


遞減雜交（subtractive hybridizatio）


是利用兩種來源一致而功能不同的組織細胞提取mRNA（或逆轉錄成的cDNA）,在一定的條件下以過量的驅(qū)動mRNA或cDNA與測試的單鏈cDNA或mRNA進行液相雜交，通過羥基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源的雜交體。經(jīng)多輪雜交策選、除去兩者之間相同的基因成分，保留特異表達的目的基因或工基因片段。以后者篩選cDNA文庫，可獲得特異表達的目的基因cDNA全長序列。


核酸原位雜交


用特定標記的已知順序核酸作為探針與細胞級或組織切片中核酸進行復性雜交并對其實行檢測的方法，稱為核酸原位雜交（nucleic acid hybridization in situ）。用來檢測DNA在細胞核或染色休上的分布，與細胞內(nèi)RNA進行雜交以研究該組織細胞中特定基因表達水閏;還用于細胞、組織中有無特異性菌、病毒檢測的研究。


該法的優(yōu)點是特異性高，可定位;能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響;不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有*的敏感性;并可完整地保持組織與細胞的形態(tài)。因此被廣泛應用于醫(yī)學生物學的研究，如基因定位、基因制失，基因易位、特異基因整合部物色檢測等研究。近年來由定性發(fā)展到定量，方法更為完善。


DNA分子克隆技術（也稱基因克隆技術）


在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉入細胞獲得大量拷貝的過程中DNA分子克隆（或基因克?。?。其基本步驟包括：制備目的基因→將目的基因與載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組→導入宿主細胞→篩選、鑒定→擴增和表達。載體（vecors）在細胞內(nèi)自我復制，并帶動重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子*相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結構與功能，隨著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫，一種是基因組文庫（genomic library）,另一種是cDNA庫。


載體：所謂載體是指攜帶靶DNA片段進入宿主細胞進行擴增和表達的工具。

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